Le CTCF est un ADN

Nature volume 616, pages 822-827 (2023)Citer cet article

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Chez les eucaryotes, l’ADN génomique est extrudé en boucles par la cohésine1. En restreignant ce processus, le facteur de liaison CCCTC (CTCF) de la protéine de liaison à l'ADN génère des domaines d'association topologique (TAD)2,3 qui jouent un rôle important dans la régulation et la recombinaison des gènes au cours du développement et de la maladie1,4,5,6,7. La manière dont le CTCF établit les limites du TAD et dans quelle mesure celles-ci sont perméables à la cohésine n'est pas claire8. Ici, pour répondre à ces questions, nous visualisons les interactions de molécules uniques de CTCF et de cohésine sur l'ADN in vitro. Nous montrons que le CTCF est suffisant pour bloquer la cohésine diffusante, reflétant peut-être la manière dont la cohésine cohésive s'accumule aux limites du TAD, et qu'il est également suffisant pour bloquer la cohésine extrudée en boucle, reflétant la manière dont le CTCF établit les limites du TAD. Le CTCF fonctionne de manière asymétrique, comme prévu ; cependant, le CTCF dépend de la tension de l'ADN. De plus, le CTCF régule l'activité d'extrusion de boucles de la cohésine en changeant sa direction et en induisant un retrait de boucle. Nos données indiquent que le CTCF n'est pas, comme supposé précédemment, simplement une barrière à l'extrusion de boucles médiée par la cohésine, mais est un régulateur actif de ce processus, par lequel la perméabilité des limites du TAD peut être modulée par la tension de l'ADN. Ces résultats révèlent les principes mécanistes de la façon dont le CTCF contrôle l’extrusion des boucles et l’architecture du génome.

Le repliement de l'ADN génomique par la cohésine joue un rôle important dans l'organisation de la chromatine, la régulation des gènes et la recombinaison1. La cohésine appartient à la famille des complexes ATPase de maintien structurel des chromosomes (SMC) qui peuvent extruder l'ADN en boucles, une activité qui a été reconstituée in vitro pour la cohésine, la condensine et SMC5/SMC6 (réf. 9, 10, 11, 12, 13,14). La cohésine remplit également une deuxième fonction en assurant la médiation de la cohésion des chromatides sœurs.

Dans les cellules individuelles, les boucles sont situées à des positions variables, ce qui suggère que les boucles sont des structures dynamiques dont la plupart sont en train d'être extrudées15,16,17. Cependant, dans les mesures de population cellulaire, des modèles émergent qui révèlent que la plupart des boucles sont formées au sein des TAD16,18,19. Le CTCF est situé aux limites des TAD18,19 et est nécessaire à leur formation et à l'accumulation de cohésine sur ces sites2,3,20. Le CTCF possède des régions N- et C-terminales non structurées qui encadrent 11 doigts de zinc, dont plusieurs reconnaissent une séquence d'ADN asymétrique et positionnent donc le CTCF de manière directionnelle sur l'ADN21,22. La plupart des sites de liaison au CTCF sont orientés dans des orientations convergentes de sorte que les extrémités N du CTCF font face à l'intérieur des TAD, ce qui suggère que le CTCF fonctionne comme une limite asymétrique pour l'extrusion de boucles médiée par la cohésine. Conformément à cette possibilité, l'extrémité N du CTCF peut se lier à la cohésine et est nécessaire pour l'isolation du TAD et l'ancrage des boucles sur ces sites.

Plusieurs mécanismes ont été suggérés pour expliquer comment le CTCF pourrait empêcher l'extrusion de boucles à travers les limites du TAD (examiné précédemment8), à savoir en tant que barrière physique (barrage routier) ; en se liant à la cohésine ; en empêchant la libération de cohésine de l'ADN, en favorisant le remplacement de la sous-unité activant l'ATPase de la cohésine, NIPBL, par son homologue inactif PDS5 ; en inhibant directement l'activité ATPase de la cohésine ; et en favorisant le piégeage de l'ADN à l'intérieur d'une structure en anneau formée de trois sous-unités de cohésine30. Il a également été proposé que le CTCF convertisse la cohésine en une enzyme à extrusion asymétrique en bloquant l'extrusion de la boucle au niveau du site lié au CTCF tout en permettant à la cohésine de continuer à enrouler l'ADN dans la boucle uniquement à partir de l'intérieur du TAD . Cependant, il reste à déterminer lequel de ces mécanismes proposés est utilisé par le CTCF et si le CTCF est suffisant pour bloquer l'extrusion de boucles par la cohésine. Répondre à ces questions est d'une grande importance, car le CTCF est nécessaire pour contrôler les interactions amplificateur-promoteur1, la reprogrammation nucléaire6, la recombinaison des gènes des récepteurs d'antigènes4,5 et le moment de la réplication de l'ADN33, et parce que les mutations du CTCF ont été impliquées dans la tumorigenèse7. Les limites du CTCF sont également des sites sur lesquels les molécules d'ADN répliquées sont reliées par des complexes de cohésine, qui assurent la cohésion34.

<), tandem (>> and <<), and divergent (<>) manner. The percentages were obtained by multiplying the blocking probability of N- and C-terminal encounters in the force range 0.04-0.08 pN, as depicted in Fig. 2e, and normalizing to 100% (see Supplementary Note). Bar heights denote mean values. Error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2e. The relative fraction of CTCF-anchored loops that we obtained from the single-molecule experiments are compared to published values extracted from Hi-C data3,63,64,65. b, Stalling force of cohesin. horizontal line median; boxes extend to the quartiles and the whiskers show the range of the data (median-1.5* interquartile range (IQR); median+1.5*IQR). Data from 2 independent experiments. c, The DNA tension measured at encounters of loop-extruding cohesin with the N- and C-terminus of CTCF and dCas9. The stalling force values from panel (b) is shown for comparison. N = 297, 184, 37, 66 for CTCF (N), CTCF (C), dCas9 and the stalling force measurements, respectively. d, The empirical survival function (1-CDF) of the data shown in panel c. Thick line represents the mean; shaded areas represent 95% confidence intervals. At the DNA tension of complete stalling at the CTCF N-terminus, 0.14 pN, the survival function decays to 53 \(\pm \) 16%, i.e. if loops would be halted by reaching the stalling force alone, one would expect ~53% of loops to exceed the DNA tension of 0.14 pN, which was not observed (compare blue line for stalling at the CTCF N-terminus and Fig. 2g). e, Ratio of the N-terminal and C-terminal blocking probabilities. N-terminal encounters block loop extrusion 3.6 ± 0.8 -fold (The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2g) more often than encounters from CTCF’s C-terminal side, independently of DNA tension. N per bin for N-terminal (n) and C-terminal (c) encounters: 0.025-0.0415 pN: 70 (n), 72 (c); 0.0415-0.058 pN: 81 (n), 67 (c); 0.058-0.075 pN: 84 (n), 30 (c); 0.075-0.091 pN: 20 (n), 14 (c); 0.091-0.1075 pN: 40 (n), 6 (c); 0.119-0.142 pN: 3 (n), 0 (c). Sample sizes refer to biological replicates. f, Fraction of blocked molecules in the cohesin diffusion assay as a function of DNA tension (note that the DNA tension is constant in diffusion assays since no DNA loop is being extruded). The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval. g, DNA tension of DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by N-terminally oriented CTCF (left; N = 74 from 2 independent experiments) or by C-terminally oriented CTCF (right; N = 27 from 5 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sided 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. h, Violin plot of DNA tension for DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by CTCF (left; N = 161 from 7 independent experiments) or repeatedly passed CTCF (right; N = 88 from 7 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median./p>

0.05, 2-sided 2-sample Kolmogorov–Smirnov test). i, Loop shrinkage rate, in comparison to cohesin loop extrusion rate (grey), and j, distribution of shrinkage time spans. Black dots represent step-wise shrinkage events that happen within one imaging time interval, i.e. 0.4 s. k, Absolute and l, relative loop size decrease for N- and C-terminal encounters in blue and red, respectively. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median. Data for N-/C-terminal encounters were collected from 13 and 3 independent measurements, respectively./p>

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